"Український ботанічний журнал"

УБЖ 2020, 77(5): 386–397

https://doi.org/10.15407/ukrbotj77.05.386

Гош С.С., Дас М., Басу С., Адікарі Ю.

Глюконеогенна фруктозо-1,6-бісфосфатаза зрілих спорокарпів звичайних видів водяних папоротей: часткове очищення та основна характеристика цього ферменту у Marsilea minuta (Polypodiopsida)

Резюме

У статті повідомляється про значну активність глюконеогенної фруктозо-1,6-бісфосфатази (ФБФ-аза; КФ 3.1.3.11) у трьох звичайних видів гетероспорових водяних папоротей (Marsilea minuta, Salvinia natans і Azolla pinnata). Крім того, наводиться протокол часткового очищення цього ферменту із зрілих спорокарпів Marsilea minuta. Цитозольна ФБФ-аза, отримана з Marsilea minuta, Salvinia natans та Azolla pinnata, визнана глюконеогенним ферментом завдяки різкій катаболічній інактивації за наявності зовнішньо введеної глюкози та нечутливості до фотосинтетичного освітлення. Цитозольна глюконеогенна ФБФ-аза із зрілих спорокарпів Marsilea minuta була частково очищена до приблизно 22-кратного рівня гомогенатом після низькошвидкісного центрифугування (11400 × g), фракціонування 30-80% сульфатом амонію і подальшого хроматографічного розділення на CM-целюлозі, Sephadex G-200 та Ultrogel AcA 34. Реєстрували профіль частково очищеної ФБФ-ази шляхом електрофорезу у нативних умовах в поліакриламідному гелі (PAGE). Активність ферменту лінійно зростала щодо концентрації білка приблизно до 100 мг упродовж періоду до 75 хвилин. Температурний оптимум установлено при 35 °С. Для визначення впливу концентрації субстрату і кінетичного аналізу використовували D-фруктозо-1,6-бісфосфат (D-ФБФ, субстрат) у діапазоні 0,0-1,0 mM з інтервалом 0,1 mM концентрації. Значення K_m для D-ФБФ ФБФ-ази становило 0,06129 mM, а V_max – 4525 nmole P_i виділеного білка h^-1 (mg)^-1, що визначали за допомогою нелінійної регресії з використанням програм Prism 8 (Graph Pad). Дія ферменту відбувалась у звуженому діапазоні рН від 7-8, а максимальні показники отримано при рН 7,5. Встановлено, що Mg²⁺ значною мірою стимулює, а Hg²⁺, Cu²⁺ і Zn²⁺ – інгібують активність цього цитозольного ферменту.